Хетчинг эмбрионов

Данный материал предназначен тем, кто интересуется технологией экстракорпорального оплодотворения, или ЭКО. Говоря простыми словами, хетчинг эмбрионов (зародыша) — это помощь юному комочку клеток в прикреплении к тканям матки, или имплантации, если есть определенный риск, что возникнут сложности. В этом и есть физиологический смысл хетчинга.

А теперь разберемся подробнее в этом вопросе, и вспомним, как каждый из нас в свое время успешно прошел период имплантации. Это успешное, и, главное, своевременное прикрепление зародыша к слизистой оболочки матки — залог нормального наступления беременности (ведь оплодотворение — это еще не беременность). Собственно, сам период имплантации или внедрения зародыша и является первым критическим периодом беременности.

Процесс физиологической имплантации

Для того чтобы понять, как помочь зародышу прочно прикрепиться в матке, посмотрим немного на нормальную структуру ещё неоплодотворенной яйцеклетки, которая схематически изображено ниже. Нас сейчас интересует только лишь оболочка яйцеклетки под номером 7, блестящая зона или зона пеллюцида (zona pellucida). Что это за структура и чем она важна для имплантации и хетчинга?

Это зона действительно блестящая, или прозрачная, и состоит из особых мукополисахаридов — гликозаминогликанов. Обычно эти крупные молекулы входят в состав соединительной ткани, например, хрящей и синовиальной или суставной жидкости. Речь идет о хондроитинсерной, сиаловой и гиалуроновой кислотах.

Кроме этого, на поверхности этой зоны расположены молекулы гликопротеинов. Они образуют особенные нити, и функционируют как рецепторы для сперматозоидов, позволяющие соединиться спермию и яйцеклетке. Другие молекулы гликопротеинов препятствуют множественному оплодотворению, или полиспермии. Блестящая зона очень богата на гликопротеины с рецепторами, и имеет десятки миллионов этих молекул.

После того, как яйцеклетка привлекла сперматозоиды с помощью хемотаксиса, выделив специфические пептиды, сперматозоиды начинают готовиться к проникновению в яйцеклетку. Эту способность они приобретают под действием слизи и секрета женских половых путей, свежие сперматозоиды к оплодотворению не способны, как это ни удивительно. Этот процесс «созревания» называется капацитацией, и длится 7 часов. Биохимический смысл капацитации — удалить особые молекула с поверхностью спермия, «почистить» его и подготовить его к оплодотворению, очистить от семенной плазмы. Ведь мороженое, даже самое лучшее, в обертке никто есть не будет. Точно так же и сперматозоид нужно подготовить: он приобретает оплодотворяющую способность благодаря прогестерону. В результате капацитации у сперматозоида буквально «срывает крышу».

Затем группа сперматозоидов вращает яйцеклетку, с помощью биения своих жгутиков. Многие сперматозоиды начинают сливаться с наружными структурами яйцеклетки, но это ещё не есть настоящее оплодотворение. Кроме дистантного взаимодействия сперматозоидов, нужен и полный контакт. Именно для этого и служат полисахариды блестящей зоны яйцеклетки. Рецепторы сперматозоида «узнают» рецепторы яйцеклетки, и только после этого объединяется цитоплазма обоих половых клеток. И самый первый, обогнавший других собратьев, сперматозоид проникает внутрь.

После того, как сперматозоид попадает внутрь, между блестящей зоной и плазмолеммой яйцеклетки, уже через несколько секунд она начинает закрывать «входные ворота» для других сперматозоидов. Хотя яйцеклетку обрабатывают сотни других сперматозоидов, но проникает только один, и он же начинает новую жизнь.

Этот феномен называется моноспермия, и характерен для млекопитающих. На рисунке ниже схематически показана толстая блестящая зона, которая изображена зелёным цветом. После того, как единственный сперматозоид проникает внутрь, чрезвычайно быстро наружные молекулы гликопротеинов прекращают быть привлекательными рецепторами для сперматозоидов, и этот процесс в виде зонной реакции охватывает всю блестящую оболочку. Все, «дверь захлопнулась», и образовалась препятствующая полиспермии (оплодотворение несколькими сперматозоидами) особая оболочка оплодотворения.

Мы так подробно рассказали о функциях в прозрачной оболочке, поскольку она в дальнейшем сыграет ключевую роль в процессе хетчинга. Далее примерно 12 часов происходит сближение гаплоидных ядер сперматозоида и яйцеклетки, генетический материал объединяется, потом образуется одноклеточный зародыш, или зигота, которая начинает дробление.

Вначале оплодотворенная яйцеклетка разделяется на два бластомера, затем добавляется третий бластомер, и вначале на это требуется много времени. Первое деление заканчивается спустя 30 часов, а, уже начиная с третьих суток, процесс размножения клеток «набирает обороты», и идет быстрее. В течение этих трёх суток оплодотворенная яйцеклетка, которая называется бластоцистой, постепенно, подгоняемая ритмической пульсацией фимбрий трубы перемещается к матке, и через 4 дня она попадает внутрь матки.

Попав в матку, она около 2 дней находится в свободном состоянии на поверхности слизистой, и к этому времени количество бластомеров увеличивается до 100 клеток, и уже возникает их первая дифференцировка на примитивные зародышевые ткани. Именно после этого и начинается стадия имплантации. Зародыш внедряется в слизистую матки.

Вначале он прилипает, происходит процесс адгезии, а затем он погружается внутрь, то есть возникает инвазия. Это обычно происходит на седьмые сутки после оплодотворения. Мы не будем углубляться в тонкости эмбриологии, скажем только, что это процесс довольно длительный, и продолжается около 40 часов. Если имплантация закончится неудачей, то зародыш погибнет, и это действительно первый критический период развития.

Имплантация — процесс непростой, сопровождается дифференцировкой вспомогательный ткани, или трофобласта. Необходимо выделение им ферментов, расщепляющих белки слизистой оболочки матки. Одновременно с этим появляются ворсины трофобласта, которые всё глубже проникают вглубь слизистой матки, разрушают её эпителий, соединительную ткань, и затем — сосудистую стенку. Цель трофобласта — добраться до кровеносных сосудов и получить гематотрофный тип питания. Ведь в течение первых двух недель трофобласт потребляет распавшиеся материнские ткани, и находится на «голодном пайке», питаясь диффузно, и только потом он начинает питаться из крови, и, в конце концов, образуются ворсины хориона, а затем и плацента вместе с плацентарным кругом кровообращения. Этот сложный процесс изображен ниже, вплоть до врастания зародыша в сосуд. Теперь первый критический период позади: началась собственно беременность.

Значение хетчинга при ЭКО

Если выполняется ЭКО, или экстракорпоральное оплодотворение, то это значит, что следует последовательно выполнить множество этапов, и учесть много факторов для полноценной беременности. И хотя, самый первый успешный опыт человеческого ЭКО начал отсчитывать своё время с 1978 года, до сих пор нет 100% уверенности в благоприятном результате. Считается значительным достижением, если вероятность забеременеть превышает 50%.

Специалисты по репродуктивным технологиям постоянно ищут методы, повышающие эффективность экстракорпорального оплодотворения, и именно одним из этих методов является помощь зародышу, который не может покинуть зону пеллюциды, которая в своё время сослужила яйцеклетке такую хорошую службу. Если существуют некоторое факторы риска, и эмбрион перенесён в полость матки, или даже два или три эмбриона, то если не провести hatching, хетчинг, то у эмбрионов может просто не хватить сил, чтобы «вылупиться» сквозь блестящую оболочку.

Эмбрион до имплантации

Мы рассмотрели строение блестящей оболочки у неоплодотворённой яйцеклетки, и разобрали, как она функционирует при оплодотворении. Что же с ней происходит после начала дробления зародыша? Рассмотрим её на фотографии. На начальных стадиях дробления, когда возникает первичная дифференцировка, вся масса эмбриона делятся на 2 подвида, или субпопуляций клеток. Одна из них — это внутренняя масса клеток, клеточная масса — ВКМ, которая и будет мальчиком или девочкой.

Вторая, периферическая часть — это трофобласт. В конце концов, это вспомогательная ткань превратится в плаценту, и во все внезародышевые оболочки. Бластоциста, которая готовится к имплантации, очень маленькая, не более 0,3 мм в поперечнике. Если посмотреть на зародыш под микроскопом, то прекрасно видно основную клеточную массу, внутреннюю полость, периферические выросты трофобласта. А наружное кольцо это и есть блестящая оболочка, или бывшая одна из оболочек неоплодотворенной яйцеклетки, или зона пеллюцида.

Как мы говорили выше, на седьмой день происходит имплантация, а на 5-6 день развития, когда зародыш еще не достиг 100 бластомеров, уже начинается процесс увеличения внутренней полости, а блестящая оболочка под давлением эмбриональных тканей постепенно начинает становиться всё тоньше и тоньше. Это естественный процесс вылупления, ведь блестящая оболочка яйцеклетки, несмотря на её нужность и необходимость в своё время, уже постепенно утрачивает свои функции.

Единственное, зачем она ещё нужна, — это механическое удержание делящихся клеток вместе, так сказать, наружный эластичный скелет на самых ранних этапах развития. У зародыша толщина её не превышает одной сотой доли миллиметра, чаще она может быть еще тоньше, и составлять толщину 5 микрометров. Она способна к диффузии воды, и растворенных минеральных веществ. Чем раньше этап развития, тем нужнее блестящая оболочка. Так, если на пятый день развития она просто удерживает клетки вместе, то до 3 дня развития без неё бластомеры совершенно развалились бы поодиночке, поскольку между этими бластомерами ещё не было нужных межклеточных контактов.

Хетчинг эмбриона — что это? Как происходит спонтанно hatching, или нормальное, физиологическое «вылупление человека»? Бластоциста просто увеличивается в размерах, объём клеточной массы повышается, а внутренняя полость бластоцисты постепенно нагнетает гидростатическое давление, поскольку эмбриональные клетки накачивают жидкость во внутреннюю полость.

Блестящая оболочка, несмотря на ее прочность (ведь ее гликозаминогликаны входят в состав фасций, связок и хрящей) постепенно начинает испытывать внутреннее давление, становится более тонкой, а затем в каком-либо участке она просто спонтанно разрывается. И буквально, как птенец, или новорождённый крокодильчик, комок эмбриональных клеток, постепенно сжимая и разжимаясь, выдавливает себя наружу, совершая первую «прогулку» в своей жизни. В это время между клетками эмбриона уже существуют плотные контакты, и, несмотря на то, что он еще отнюдь не напоминает человека, а представляет собой комок из нескольких десятков клеток, он не распадается, а оказывается в окружающей среде, то есть в слизистой оболочки матки. Вылупившийся эмбрион готов к двухдневному отдыху, набору клеточной массы и взаимодействию с эндометрием. На него начинает влиять среда полости матки, точно так же, как и клетки зародыша, посылая особые химические сигналы, влияют на эндометрий.

Хетчинг в программе ЭКО

Теперь становится совсем понятно, что такое хетчинг при экстракорпоральном оплодотворении. Это просто искусственная помощь эмбриону, «проделывание дырки», и придание ей необходимых размеров, чтобы эмбрион свободно вылупился. Репродуктологи учитывают тот фактор, что неспособность к имплантации — это одна из важнейших причин бесплодия. Если освободить бластоцисту от своей оболочки, то этот эмбрион не будет тратить энергию на процесс вылупления, что позволит ему полноценно использовать её на имплантацию.

Собственно, английский глагол «hatch» так и переводится, как «проклюнуться», и в птицеводстве это означает помощь птенцу, проделывание отверстия в скорлупе. Поэтому перед тем, как перенести зародыша в полость матки, в прозрачной оболочке делают отверстия, или делают её тоньше.

Однако, эта процедура не входит в обязательные стандарты ЭКО, и является в большой степени вспомогательной, и для этого нужны особые показания. Ведь хетчинг — это ювелирная техника, с использованием микроинструментария. Обычно стандартная процедура у опытного специалиста занимает около 10 минут, а после этого зародыш помещается обратно в чашу с питательным субстратом и закладывается в инкубатор, чтобы потом быть перенесенным в полость матки. Каким же бывает хетчинг, и каковы показания к его проведению?

Виды вспомогательного хетчинга и показания

Классификация видов хетчинга наиболее удобна по характеру воздействия:

• самый древний способ, который используется уже на протяжении 30 лет, — это механическое разрушение прозрачной оболочки. Для этого под микроскопом вводится специальная микроигла, причём под особым углом, практически по касательной к периметру пеллюциды эмбриона. Это направление нужно, чтобы не повредить главную клеточную массу и трофобласт, несмотря на то, что он несет вспомогательную функцию (см. рис.)
• следующий, тоже давно используемый вид хетчинга — это химический. Для этого нужно уже не микроигла, а микропипетка, с помощью которой на самую безопасную зону эмбриона, максимально удаленную от главной клеточной массы, наносят особые растворы кислых ферментов. Затем нужно немного подождать, и после того, как в прозрачной оболочке возникнет отверстие, диаметр которого примерно составляет 25 мкм, то есть около 2,5 сотых доли миллиметра, затем ненужный раствор смывают, чтобы он не продолжал разъедать ткани зародыша;
• можно использовать пьезоэлектрический метод, когда кварцевый микроманипулятор на своём конце обладает вибрацией высокой частоты. Такая вибрация безопасна для эмбриона, но она проделывает небольшие ямки, приводит к деструкции прозрачную зону, и такая изъеденная пьезоэлектрическим зондом оболочка зародыша очень быстро разрушается;
• Наконец, возможен и лазерный способ деструкции прозрачный зоны, когда подбирается особая длина волны, диаметр лазерного луча, и количество энергии. Лазерный хетчинг — самый современный способ, поскольку он не предполагает никакого контакта: механического, термического, пьезоэлектрического и химического с эмбрионом. Лазерный луч не соприкасается с клеткой, оставляя ее полностью жизнеспособной. Именно о лазерном хетчинге эмбрионов отзывы, как о наиболее современной процедуре.

Современные системы состоят из двух видов лазера: видимого, по которому осуществляется прицеливание оператором, и невидимого, который повторяет ход видимого луча. Всё действие видно на цифровом экране, с регуляцией размера прожигаемой зоны и возможностью получать высококачественные снимки, и даже запись видео. Современная система для лазерного хетчинга имеет программное обеспечение, и если прицеливающий лазер имеет длину волны 635 нанометров, то есть, это красный светодиодный лазер, «лазерная указка», то основной лазер имеет длину волны 1480 нанометров. Соответственно, у него более высокая мощность.

Показания к хетчингу

При каких условиях желательно проводить хетчинг? Главные показания — это:

• охлаждённые эмбрионы, которые перенесли криоконсервацию, или в оплодотворении которых участвовали заранее криоконсервированные ооциты;
• блестящая оболочка имеет ненормально большую толщину, которую сложно будет преодолеть эмбриону, или неравномерно толстая. Блестящая оболочка большой толщины и высокой плотности чаще всего связана как раз со значительным возрастом женщины, поэтому он выделяется в отдельную группу риска. Но, однако, к этому могут привести долгие мероприятия, когда стимулировали овуляцию. Если толщина оболочки превышает определенные показатели, необходимо прибегать к хетчингу;
• возраст матери старше 38 лет (по вышеуказанным причинам);
• если будущая мать курит — нужен хетчинг;
• если раньше были несколько попыток ЭКО, и все они закончились неудачной имплантацией, однако при этом эмбрионы были «хорошего качества», а эндометрий был нормальный;
• если необходимо провести генетическую диагностику перед имплантацией, в таком случае рекомендуется механический способ с забором генетического материала;
• если у женщины высок фолликулостимулирующий гормон в плазме крови. Высокий уровень ФСГ всегда значительно повышает риск проведения ЭКО, и если на 3 день цикла ФСГ превышает 15 единиц, то тогда необходимо прикрываться искусственным хетчингом.

Также специалистам нужно внимательно отметить эмбрионы, которые готовы к имплантации. Если у них нарушена скорость дробления или она вялая, если есть аномальные безъядерные фрагменты, если имеет место отклонение от формы, — то всё это может изменить нормальное течение имплантации, и тогда необходим хетчинг. Кроме того, эмбрионы различаются по классам качества, и наиболее высокий из них — третий и четвёртый класс. Поэтому если эмбрионы принадлежат к другим классам, а фрагментация их клеточного состава превосходит количество в 10%, или если эмбрион содержит менее 6 бластомеров, то тоже необходимо прибегать к этому виду «ранней помощи».

Остаётся осветить последний вопрос. Какова стоимость процедуры? В зависимости от разновидности клиники, от города, от способа он может колебаться от 3000 до 15000 руб.

Источники

1. Robert W. Rebar , MD, Western Michigan University Homer Stryker M.D. School of Medicine January 2019 Assisted Reproductive Technologies
2. Гистология, учебник для медицинских институтов, ред. акад. Афанасьева
3. Исупова О. Г.ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЕ РЕПРОДУКТИВНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ: НОВЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ  Изд. ВШЭ, 2016
4. Руководство по вспомогательным репродуктивным технологиям для врачей и эмбриологов | Корсак Владислав Станиславович 2015